Luna Cell Ready染料一步法 RT-qPCR 试剂盒 收藏
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特性
无需纯化,直接从细胞到 RNA 定量
• 试剂盒包含 100 次裂解反应和 500 次染料一步法 RT-qPCR 反应
• 有效裂解多种细胞系的 10 至 10 万个细胞
• 仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除
• 联合使用 LunaWarmStart® RT 和 Hot Start Taq,提高了热稳定性,且可在室温下建立反应体系
• 可单独购买裂解模块:Luna Cell Ready 裂解模块(NEB#E3032)
概述
Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接染料法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分,且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒包括:1)Luna Cell Ready 裂解模块(NEB#E3032S)和 2)Luna 通用一步法 RT-qPCR Kit(NEB#E3005L)。
细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。
Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能,仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂,可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10-10 万个细胞进行裂解反应。2 µl 裂解产物 (相当于 0.2–4000 个细胞的 RNA) 即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样,裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料,使整个加样流程可视化。
Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的 SYBR/FAM 荧光通道,进行目标 RNA 的实时定量分析。在该试剂盒中,联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶,通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接将 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量。
下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释(100000-10 细胞/50 µl 裂解反应),并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外,经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。
细胞系 |
|
特性 |
菌种 |
50 ml 裂解体系中的细胞数量 |
A549 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
HEK293 |
Adherent |
H. sapiens, Kidney |
10 – 100,000 |
HeLa |
Adherent |
H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma |
10 – 100,000 |
HepG2 |
Adherent |
H. sapiens, Liver, carcinoma |
10 – 100,000 |
NCI-H460 |
Adherent |
H. sapiens, Lung, carcinoma |
10 – 100,000 |
SK-N-SH |
Adherent |
H. sapiens, Brain, Neuroblastoma |
10 – 100,000 |
U2Os |
Adherent |
H. sapiens, Bone, osteosarcoma |
10 – 10,000 |
Jurkat |
Suspension |
H. sapiens, T lymphocyte, leukemia |
10 – 100,000 |
K-562 |
Suspension |
H. sapiens, Lymphoblast, leukemia |
10 – 1,000 |
图一:Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程
Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从细胞(50 µl 体系可裂解高达 10 万个细胞)到 RNA 检测和定量的所有组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能,仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物(相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA)即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。
图二:Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对 5-log 梯度稀释细胞的裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量
梯度稀释的 A549 细胞(100,000-10)使用标准反应条件(37°C 裂解 10 分钟,25°C 灭活 5 分钟),在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系(NEB#E3032)中裂解。使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEB#E3005)加入 1 μl 细胞裂解物(相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞)对目的基因(GOI)进行定量,每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高频靶标(A):β-actin 和一个低频靶标(B):SMG1。右图展示了扩增效率(E)和线性关系(R2)。
图三:Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒与提纯 RNA 均可对 5-logs 细胞梯度样品进行精准可信的 RNA 定量
梯度稀释的 A549 细胞(100,000-10)使用标准反应条件(37°C 裂解 10 分钟,25°C 灭活 5 分钟),在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系(NEB#E3032)中裂解,也可使用柱提法提纯 RNA。A.使用 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEB#E3005)对目的基因(GOI)进行定量,加入 1 μl 细胞裂解物(实心圆)或纯化的 RNA(空心圆)(相当于 20 µl RT-qPCR 反应中有 0.2-2,000 个细胞),每个浓度的样品都做了重复。左图:在 5-logs 细胞梯度中检测高频靶标 β-actin和两个低频靶标 ARF3 和 Tubulin。每个靶标的扩增效率在图中左下方显示。B.在 A 图中 5-log 细胞梯度稀释样品的目标基因相对于 β-actin 的 Cq 值(ΔCq(GOI)),平均 Cqs 通过横线指示。
图四:Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。
梯度稀释的 A549 细胞(100,000-10)使用标准反应条件,在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系(NEB#E3032)中裂解。相同的样品使用 Bio-Rad(SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095)、Qiagen(SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095)和 Thermo Fisher(Cells-to-CT 1-Step PowerSYBR Green Kit, A25600)并分别按照厂家说明书进行裂解。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块,加入 1 μl 细胞裂解物(相当于 20 μl RT-qPCR 反应体系中 0.2-2,000 个细胞),对目的基因进行定量,每个浓度的样品都做了重复。对于所有试剂盒,5-log 梯度稀释细胞均显示了 β-actin,(高频靶标)和 RPL32、Tubulin (低频靶标)的扩增。为了使结果标准化,将总荧光的 12% 设置为阈值。图中显示了扩增效率(E)及最高与最低的 Cq 值。
图五:对 24 个靶标测试显示,Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒与其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒相比,灵敏度最高。
2500 个 A549 细胞,使用标准反应条件,在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系(NEB#E3032)中裂解。或使用市售的 Bio-Rad(SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095)、Qiagen(SingleShot SYBR Green One-Step Kit, #172-5095)和 Thermo Fisher(Cells-to-CT 1-Step PowerSYBR Green Kit, A25600)并分别按照厂家说明书进行裂解。每个试剂盒做两个生物重复。然后使用来自每个试剂盒的一步法 RT-qPCR 模块,加入 1 μl 细胞裂解物(相当于 20 µl RT-qPCR 反应中 50 个细胞),对 24 个目标基因进行定量,每个生物样品均做重复。结果显示了 NEB (实心橙色圆圈),BioRad(空心正方形),Qiagen(空心三角形)和 Thermo Fisher(十字形)的平均 Cqs。为了使结果标准化,将总荧光的 12% 设置为阈值。Luna Cell Ready 染料一步法 RT-qPCR 试剂盒显示了不同表达水平下 23/24 的基因 Cq 值最早,平均比 Bio-Rad 快2.3 Cq,比 Qiagen 快 3.8 Cq,比 Thermo Fisher 快 3.6 Cq。
随该产品提供的试剂
储存(°C) |
|
浓度 |
|
Luna Cell Ready Lysis Buffer |
-20 |
2 X |
Luna Cell Ready RNA Protection Reagent |
-20 |
25 X |
Luna Cell Ready Protease |
-20 |
25 X |
Luna Cell Ready Stop Solution |
-20 |
10 X |
DNase I (RNase-free) |
-20 |
10 X |
Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix |
-20 |
20 X |
Luna® Universal One-Step Reaction Mix |